如何減少ELISA試劑盒實(shí)驗(yàn)中背景因素的影響?

  ELISA試劑盒實(shí)驗(yàn)的原理在我們平時(shí)看來(lái)覺(jué)得很簡(jiǎn)單，無(wú)非就是固定抗原，添加一抗、二抗和底物，間中夾雜著洗滌和閉。然而，即使是平常的洗滌和封閉，如果做得不太好，也有可能影響整個(gè)實(shí)驗(yàn)。在做完實(shí)驗(yàn)時(shí)，我們是否能獲得有用的信息，這在很大程度上取決于結(jié)果的信噪比。背景噪音會(huì)直接關(guān)系到結(jié)果的判斷。那么怎樣才能降低ELISA試劑盒實(shí)驗(yàn)中的背景因素呢，今天古朵生物技術(shù)小編我們一起來(lái)了解。

  洗滌很重要

  洗滌步驟看似很無(wú)聊，其實(shí)很重要，因?yàn)槿绻唇Y(jié)合的材料(如非特異結(jié)合的抗體或檢測(cè)試劑)殘留在微孔板中，那么它會(huì)增加背景噪音。如有必要，可增加洗滌液中的鹽濃度，這會(huì)阻止非特異結(jié)合反應(yīng)。如果背景過(guò)高，而您懷疑洗滌不夠時(shí)，可以嘗試增加洗滌次數(shù)。

  封閉關(guān)鍵

  封閉液的作用是讓不相關(guān)的蛋白占據(jù)微孔板中潛在的結(jié)合位點(diǎn)。這就降低了可產(chǎn)生信號(hào)的抗體非特異結(jié)合的機(jī)會(huì)。您當(dāng)然也希望抗體只與目的蛋白結(jié)合吧。如果您的背景過(guò)高，懷疑封閉不充分，那么您可以嘗試使用高濃度的封閉液，或適當(dāng)延長(zhǎng)封閉時(shí)間。如果您一直被背景問(wèn)題所困擾，那么也許您該花些時(shí)間來(lái)優(yōu)化封閉液。這可能需要時(shí)間，但也是值得的。目前主要有兩種類型的封閉液：蛋白和非離子型去污劑。您使用的類型須取決于多個(gè)因素，包括微孔板的表面試劑、吸附的抗原、您的抗體和檢測(cè)試劑。好的封閉液應(yīng)降低非特異性結(jié)合，但它不應(yīng)當(dāng)與抗原、抗體或檢測(cè)試劑發(fā)生相互作用。常用的非離子型去污劑是Tween-20。這種封閉液便宜、穩(wěn)定，在去除洗滌過(guò)程中的一些非特異結(jié)合上很有用。但它們只在存在時(shí)起作用，因?yàn)楹苋菀妆幌吹簟Ｒ虼怂邢礈煲褐幸脖仨毺砑臃忾]液。請(qǐng)勿使用高濃度(正常濃度為0.01-0.1%)，它會(huì)降低特異結(jié)合，產(chǎn)生假陰性。另一個(gè)選擇是使用蛋白和非離子型去污劑這兩種封閉液，后者可協(xié)助洗滌過(guò)程中的封閉。蛋白封閉液則有所不同。它們與開(kāi)放位點(diǎn)結(jié)合并封閉，同時(shí)穩(wěn)定與微孔板結(jié)合的抗原分子。常用的蛋白封閉液包括牛血清白蛋白(BSA)、脫脂奶粉、正常血清和魚(yú)明膠。

  抗體濃度須優(yōu)化

  如果試劑稍有不同，則可能需要優(yōu)化抗體的量。記住，非特異的抗體結(jié)合會(huì)增加背景。為了防止這一點(diǎn)，切勿使用過(guò)多的一抗或二抗。

  檢測(cè)試劑要適量

  另一點(diǎn)也很顯而易見(jiàn)：切勿使用過(guò)多的檢測(cè)試劑。如果濃度過(guò)高，或者未正確稀釋，則會(huì)導(dǎo)致高背景。也不要顯色過(guò)度，如有必要，優(yōu)化一下何時(shí)應(yīng)加入終止液。

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