標(biāo)簽：蛋白-DNA 古朵生物 凝膠電泳

  凝膠遷移實驗(EMSA)實驗相關(guān)資料

  凝膠遷移實驗有稱凝膠阻滯實驗或電泳遷移率實驗(EMSA，electrophoretic mobility shift assay)，是一種用于蛋白與核算相互作用的技術(shù)。初是用于轉(zhuǎn)錄因子與啟動子相互作用的驗證性實驗，也可應(yīng)用與蛋白-DNA、蛋白-RNA互作研究。

  一、實驗原理

  EMSA主要基于蛋白-探針復(fù)合物在在凝膠電泳過程中遷移較慢的原理。根據(jù)實驗設(shè)計特異性和非特異性探針，當(dāng)核酸探針與樣本蛋白混合孵育時，樣本中可以與核酸探針結(jié)合的蛋白質(zhì)與探針形成蛋白-探針復(fù)合物;這種復(fù)合物由于分子量大，在進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳時遷移較慢，而沒有結(jié)合蛋白的探針則較快;孵育的樣本在進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳并轉(zhuǎn)膜后，蛋白-探針復(fù)合物會在膜靠前的位置形成一條帶，說明有蛋白與目標(biāo)探針發(fā)送互作。

  二、實驗操作步驟

  1、實驗前準(zhǔn)備

  (1)合理的實驗方案

  根據(jù)研究目的合理設(shè)計特異性探針實驗組以及非特異性探針對照組，如有必要還可以添加特異性抗體組、特異性核酸競爭組等

  (2)樣本制備

  可以選擇提取樣本的總蛋白、核蛋白或者使用純化好的目的蛋白。對樣本蛋白進(jìn)行定量，實驗中等量加入蛋白。

  (3)探針制備

  根據(jù)實驗要求設(shè)計不同的探針并添加標(biāo)記，可以合成核酸后自行添加，部分已知蛋白有商業(yè)化的抗體也可以直接購買。現(xiàn)在大多數(shù)實驗室已經(jīng)不再使用放射性標(biāo)記，生物素使用相對較多。

  2、形成蛋白-探針復(fù)合物

  (1)在0.5ml離心管中按順序?qū)⑾铝薪M份混勻：

  蛋白樣本(2-5μg)Xμl

  poly d(I-C)1μl

  Binding Buffer2μl

  Nuclease-Free ddH2OXμl

  總體積9μl

  (2)冰浴5min后，加入1μ探針。(對照組加1ul對照探針)

  (3)PCR儀中室溫(20-23℃)溫育30min。

  3、制備凝膠，電泳

  (1)制備6.5%非變性聚丙烯酰胺凝膠：(注意根據(jù)試劑情況按比例調(diào)整總體積)

  5XTBE1ml

  30%Acrylamide/Bis2.2ml

  deionized,sterilewater6.62ml

  80%Glycerol80μl

  10%AP90μl

  TEMED10μl

  總體積10ml

  (2)按標(biāo)準(zhǔn)步驟制備凝膠。

  (3)加樣前先在預(yù)冷的0.5X TBE buffer中120V預(yù)電泳10min，與電泳完畢后沖洗加樣孔。

  (4)混合樣本及電泳緩沖液，點樣電泳。

  (5)將電泳槽置于冰上或者4℃環(huán)境中，恒壓100V進(jìn)行電泳，直至緩沖液指示帶距離凝膠底部2~3cm為止。(大約50-60min，根據(jù)實際情況調(diào)整電泳時間及電壓;電泳時間不宜過長)

  4、轉(zhuǎn)膜

  (1)在預(yù)冷的0.5XTBE中浸泡凝膠，膜，濾紙和纖維墊。

  (2)按如下順序組裝“三明治”：纖維墊，濾紙，凝膠，膜，濾紙，纖維墊。注意電極，確保凝膠位于陰極、膜位于陽極。

  (3)在預(yù)冷的0.5XTBE中進(jìn)行轉(zhuǎn)膜。轉(zhuǎn)膜裝置應(yīng)置于冰上或者低溫室中，恒壓60V轉(zhuǎn)膜1h。(注意根據(jù)實際情況調(diào)整電壓及時間)。

  5、檢測

  (1)去除轉(zhuǎn)好的膜，放入合適的盛有緩沖液的容器中，沖洗。(注意整個檢測過程避免膜干燥)

  (2)去掉沖洗緩沖液，加入封閉液后輕微震蕩，室溫封閉20min。

  (3)加入適量的HRP酶標(biāo)記的鏈霉親和素(Streptavidin-HRP conjugate)，室溫震蕩孵育45min。(勿將酶標(biāo)記物直接加到膜上)

  (4)去掉酶聯(lián)物稀釋液，用洗滌緩沖液洗膜三次，每次室溫輕微震蕩1 0min。

  (5)配置反應(yīng)底物，均勻加至膜上，室溫孵育5min。(可以在加完底物后，用薄膜輕輕覆蓋在膜上，是底物均勻覆蓋，注意不要產(chǎn)生氣泡)

  (6)化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)曝光成像(曝光時間的長短可以根據(jù)檢測方法不同而進(jìn)行相應(yīng)調(diào)整)。

  常見問題

  1、為什么看不到遷移帶?

  1)蛋白樣本提取質(zhì)量不高，蛋白降解或者提取量不足。

  2)樣本中沒有可以與探針結(jié)合的蛋白。

  3)探針與蛋白無特異性的相互作用。

  4)轉(zhuǎn)膜效率低，蛋白或者探針未轉(zhuǎn)移到膜上。

  5)曝光或者成像時間過短。

  在Super-Shift EMSA測定中看不到Super-Shift DNA/蛋白復(fù)合物帶還可能有以下原因：

  6)抗體沒有工作。不是所有的抗體都可以用于Super-Shift EMSA，只有對非變性蛋白的表面抗原決定簇起反應(yīng)的抗體才能夠用于Super-Shift EMSA。

  7)測定的活化的DNA/蛋白復(fù)合物中沒有希望檢測的構(gòu)成成分存在。此時既看不到Super-Shift的帶，也看不到DNA/蛋白復(fù)合物的量的減少

  8)使用的抗體過度稀釋。一般10-20ul的反應(yīng)液需要使用0.5-1ul原倍的抗體。

  9)多抗與DNA/蛋白復(fù)合物形成大的聚集物而不進(jìn)膠。在這種情況下，雖然看不到Super-Shift的帶，但應(yīng)當(dāng)可以看到DAN/蛋白復(fù)合物的電泳帶明顯減少。

  2、為什么實驗背景高?

  1)曝光或者成像時間過長。

  2)封閉時間不足或者效率不高。

  3)洗滌效果不佳。

  4)實驗過程中膜沒有一直處于濕潤狀態(tài)。

  3、EMSA測定需要多少量的蛋白與標(biāo)記的探針?

  對每一個特定的結(jié)合蛋白和探針，所用的純化蛋白，部分純化蛋白，粗制核抽提液需作優(yōu)化：一般所用純化蛋白的量在20-2000ng間，可將蛋白:DNA的等摩爾比調(diào)整為蛋白的摩爾數(shù)是DNA的5倍;用粗制核抽提液，需要2-10ug蛋白形成特異的復(fù)合物。

  部分純化蛋白與粗制核抽提液應(yīng)保存在-80℃、探針應(yīng)保存在-20℃以防止降解。

  無論探針或是結(jié)合蛋白都應(yīng)避免多次凍融。

  4、Poly(dI:dC)，非特異性競爭DNA，特異性競爭DNA在EMSA測定中的作用?

  Poly(dI:dC)由肌苷和胞嘧啶組成。在EMSA反應(yīng)中加入poly(dI:dC)，可抑制粗制核抽提液中轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子與標(biāo)記探針的非特異結(jié)合。結(jié)合溶液中的poly(dI:dC)的用量需在正式實驗前進(jìn)行優(yōu)化，一般用量大約在0.05mg/ml左右。當(dāng)用純化的蛋白作凝膠遷移反應(yīng)時，不必一定加入poly(dI:dC)，如加入，則普通反應(yīng)中所用終濃度不超過50-100ng。對核抽提液，每2-3ug核抽提液用1 ug poly(dI:dC)。

  為確定所形成的復(fù)合物的特異性，在含或不含增量的特異競爭DNA或非特異的競爭DNA時，作結(jié)合反應(yīng)的競爭實驗。一般，特異競爭探針是非標(biāo)記的DNA，其序列與標(biāo)記探針相同，故能與標(biāo)記探針競爭與結(jié)合蛋白的反應(yīng)。非特異競爭探針的長度組成和DNA探針相同，但序列不同。如果結(jié)合蛋白與標(biāo)記探針的結(jié)合被特異競爭探針抑制，而不受非特異探針的影響表明靶結(jié)合蛋白的存在。特異與非特異性競爭DNA的用量也需優(yōu)化或滴定，但競爭DNA通常是標(biāo)記的探針用量的30-100倍(w/w)。

  5、用什么凝膠條件將蛋白質(zhì)/探針復(fù)合物和游離的探針分離開?

  將結(jié)合蛋白或粗制核抽提液和目的探針結(jié)合，蛋白/探針復(fù)合物和游離探針可在非變性聚丙烯酰胺凝膠中經(jīng)電泳分離。聚丙烯酰胺的濃度一般為6%，在特定條件下可用高或低的濃度。也可將TGE緩沖液(12.5mM Tris，pH8.3，95mM 甘氨酸，0.5mM EDTA)用于不穩(wěn)定的蛋白/DNA復(fù)合物。在4℃進(jìn)行結(jié)合和電泳實驗以阻止不穩(wěn)定復(fù)合物和探針的解離。

  當(dāng)帶型不緊密出現(xiàn)拖尾時，表明復(fù)合物存在解離。凝膠必需完全聚合，以避免帶型拖尾。如復(fù)合物不進(jìn)入凝膠則表明所用的蛋白或探針過量，或鹽的濃度過量不適用于這一反應(yīng)。在含抽提液的帶中不含游離探針或復(fù)合物，但只含探針的帶中有探針表明抽提物有核酸或磷酸酶污染，應(yīng)在抽提液中和結(jié)合反應(yīng)中加入相應(yīng)的抑制劑。

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