轉(zhuǎn)染可謂是做生物學實驗的大家經(jīng)常會考慮的一項實驗技術，大致原理也都是明白的。到底轉(zhuǎn)染是什么呢，為什么轉(zhuǎn)染效率不高呢，今天我們就來一起討論一下其中奧妙吧。

  轉(zhuǎn)染，就是在真核細胞里導入具有生物功能的核酸，并在細胞中維持其生物功能。

  轉(zhuǎn)染方法的選擇

  我們熟知且常用的轉(zhuǎn)染方法主要有物理介導，化學介導，生物介導。但實驗室使用較多的主要有化學介導中的脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染（質(zhì)粒轉(zhuǎn)染）和生物介導中的慢病毒轉(zhuǎn)染法。其中質(zhì)粒轉(zhuǎn)染操作簡單，一般瞬時轉(zhuǎn)染選擇較多，但有些細胞系不容易轉(zhuǎn)染，因此選擇轉(zhuǎn)染方式時一定要做足功課，親身經(jīng)歷告訴我，千萬不要圖方便，否則轉(zhuǎn)染效率簡直崩潰。特別是養(yǎng)原代細胞的小伙伴，一點要認真選擇！病毒轉(zhuǎn)染一般具有能夠穩(wěn)定表達的優(yōu)勢，且其對原代細胞有較高的轉(zhuǎn)染效率，其中分為慢病毒轉(zhuǎn)染，逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)染和腺病毒轉(zhuǎn)染，其中腺病毒轉(zhuǎn)染可適合為難轉(zhuǎn)染的細胞，例如懸浮細胞、T細胞、raw細胞等難轉(zhuǎn)染細胞。

  轉(zhuǎn)染技術的注意事項

  1、細胞狀態(tài)

  眾suo周知，細胞的生長狀態(tài)影響實驗結果，原代細胞和傳代次數(shù)多的細胞都不是佳選擇，處于對數(shù)生長期的細胞生長狀態(tài)好，shi合轉(zhuǎn)染。同時，我們都知道細胞的密度不宜過大，大家往往注意的都是轉(zhuǎn)染前的密度，失敗過很多次的經(jīng)歷告訴大家，轉(zhuǎn)染后的細胞密度加重要。有時候轉(zhuǎn)染時間太久，等到進行后續(xù)實驗時細胞已經(jīng)肆意生長，漂起來了，豈不前功盡棄，流著眼淚也要告訴大家，考慮好細胞的生長周期和轉(zhuǎn)染的時間進行鋪板，建議選擇50%~80%區(qū)間密度進行細胞轉(zhuǎn)染。

  2、實驗污染

  跟細胞有關的實驗當然要注意不能污染啦，細菌，真菌，支原體都是應該嚴格注意的，不僅會浪費試劑，也會影響實驗結果。(注：支原體污染不易觀察到，轉(zhuǎn)染前可用環(huán)丙沙星處理避免污染)

  3、轉(zhuǎn)染試劑的處理

  質(zhì)粒轉(zhuǎn)染：1. 質(zhì)粒的純度會影響轉(zhuǎn)染的效率，如果質(zhì)粒不純，其含有少量的鹽，蛋白會嚴重影響轉(zhuǎn)染復合體的形成，因為內(nèi)毒素嚴重影響轉(zhuǎn)染效率，還需進行質(zhì)粒內(nèi)毒素的處理。

  2. 其次如選用lipo2000或lipo3000，需注意嚴格按照說明書的加樣順序添加，其中mix well只需用槍輕輕混勻或手指輕輕晃動，切忌用力吹打，會導致脂質(zhì)體失去作用。

  3. 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染時需用無血清的Opti-MEM Medium，關于是否嚴格控制雙抗，hao咨詢一下轉(zhuǎn)染試劑廠家技術，本實驗室用的lipo3000咨詢過技術支持，說使用雙抗并不影響轉(zhuǎn)染效率，害怕污染的小伙伴們可以放心使用啦。

  穩(wěn)轉(zhuǎn)株的篩選

  根據(jù)不同的實驗需求，如需進行劃痕，transwell等培養(yǎng)時間較長的實驗，好使用穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞株，而我的實驗后收細胞只需檢測相應蛋白的表達不用較長時間培養(yǎng)，選擇瞬轉(zhuǎn)即可。質(zhì)粒轉(zhuǎn)染一般是瞬時轉(zhuǎn)染，如需篩選穩(wěn)定株需要在藥物的作用下，因常用質(zhì)粒載體pcDNA3.1，其含有neomycin的基因，可選擇G418進行篩選，根據(jù)教程需要提前對不同濃度的G418進行細胞篩選，選擇適篩選濃度，提供一個小tip！可以通過閱讀文獻，選擇一定的濃度區(qū)間大梯度進行篩選，在全部存活和死亡較多的兩個濃度間再設定濃度梯度進行篩選，這樣得出的篩選濃度為準確。同時由于基因轉(zhuǎn)染進入細胞內(nèi)需要一定時間才能夠表達出相應的蛋白質(zhì)，但如果轉(zhuǎn)染時間較長，細胞代謝時間較久，轉(zhuǎn)染細胞也會逐漸減少，因此要合理控制進行篩選的時間。注意：藥物篩選時細胞密度不要太低，否則密度太低全部篩死就可以快樂地進行下一次實驗了。

  轉(zhuǎn)染效率的驗證

  1、有效的驗證方式必須是qPCR驗證

  2、熒光觀察，使用病毒轉(zhuǎn)染，明白自己病毒的情況，是熒光標記（一般是GFP）還是非熒光標記。質(zhì)粒轉(zhuǎn)染，可以在載體上添加熒光標記，幫助自己通過熒光觀察轉(zhuǎn)染效率。但是熒光并不能完全證明轉(zhuǎn)染效率，還是通過核酸驗證為準確。