導(dǎo)讀：梯度PCR儀因為被擴增的不同DNA片段，其適退火溫度事不同，通過設(shè)置一系列的梯度退火溫度進行擴增，從而一次性PCR擴增，就可以篩選出表達量高的適退火溫度，進行有效的擴增。主要用于研究未知DNA退火溫度的擴增，這樣節(jié)約成本的同時也節(jié)約了時間。主要用于科研，教學(xué)機構(gòu)。梯度PCR儀，在不設(shè)置梯度的情況下也可以做普通PCR擴增。
梯度PCR儀使用注意事項
1、 制備測序模板：PCR儀擴增的產(chǎn)物可以經(jīng)過低熔點的瓊脂糖凝膠電泳純化回收后，用于序列分析；可經(jīng)過柱層析純化，去除PCR儀反應(yīng)后剩余的dNTP和引物后，用于序列分析。PCR儀產(chǎn)物也可不經(jīng)純化直接用于測序，但是這種測序產(chǎn)生的結(jié)果較差，建議測序之前應(yīng)進行PCR產(chǎn)物的純化。各種標準的質(zhì)粒制備方法所純化出的質(zhì)粒均可作為測序模板使用。用標準方法制備的M13噬菌體、粘粒、λDNA都適合用作測序模板用。但要注意的是反應(yīng)體系中不應(yīng)有與引物互補的非目的基因序列，否則將會導(dǎo)致測序?qū)嶒灥氖　?br /> 2、 測序引物：測序引物是指合成的與測序模板鏈特異性互補的寡核苷酸序列?？捎忙?32P-dATP和T4多聚核苷酸激酶對引物的5‘端進行標記，反應(yīng)體系中引物、激酶和α-32P-dATP要保持在佳的比例，以得到高比活性的標記引物；也可用α-32P-dATP標記新合成的DNA鏈。引物的濃度不宜高，否則容易形成引物二聚體，或產(chǎn)生非特異性的擴增引物。
3、 酶：各種缺乏3‘—5‘端外切活性的耐熱DNA聚合酶都可以用于循環(huán)測序，其中TaqDNA聚合酶在DNA測序中為常用。雖然應(yīng)用PCR循環(huán)測序法能夠簡單、快速的進行基因序列的測定，但仍未能適應(yīng)大規(guī)模DNA序列測定的需要，而PCR循環(huán)測序法、熒光標記和自動測序儀的聯(lián)合使用成為大規(guī)?；蚪M測序的主要技術(shù)。該技術(shù)是采用熒光標記引物或雙脫氧核苷三磷酸，反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳后，經(jīng)特定的DNA序列分析儀和分析系統(tǒng)處理待測的DNA序列。它的應(yīng)用減輕了DNA序列測定的工作量，提高了測序的效率。
梯度PCR儀設(shè)計引物應(yīng)遵循以下原則：
①引物長度： 15-30bp，常用為20bp左右。
②引物擴增跨度： 以200-500bp為宜，特定條件下可擴增長至10kb的片段。
③引物堿基：G+C含量以40-60%為宜，G+C太少擴增效果不佳，G+C過多易出現(xiàn)非特異條帶。ATGC隨機分布，避免5個以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列。
④避免引物內(nèi)部出現(xiàn)二級結(jié)構(gòu)，避免兩條引物間互補，特別是3’端的互補，否則會形成引物二聚體，產(chǎn)生非特異的擴增條帶。
⑤引物3’端的堿基，特別是末及倒數(shù)第二個堿基，應(yīng)嚴格要求配對，以避免因末端堿基不配對而導(dǎo)致PCR失敗。
⑥引物中有或能加上合適的酶切位點，被擴增的靶序列有適宜的酶切位點，這對酶切分析或分子克隆很有好處。
⑦引物的特異性：引物應(yīng)與核酸序列數(shù)據(jù)庫的其它序列無明顯同源性。