北京百奧萊博供應(yīng)的牛支原體(mycoplasma)單重?zé)晒釶CR檢測試劑盒用于科研試驗，我公司專注于動物疫病PCR檢測試劑盒產(chǎn)品的研發(fā)、生產(chǎn)和供應(yīng)，為您提供的牛支原體(mycoplasma)單重?zé)晒釶CR檢測試劑盒質(zhì)量可靠，批間差小，且價格公道，熱切盼望您選購我們的產(chǎn)品。...

特別提示：包括牛支原體(mycoplasma)單重?zé)晒釶CR檢測試劑盒在內(nèi)，本公司的所有產(chǎn)品僅可用于科研實驗，嚴禁用于臨床醫(yī)療及其他非科研用途！

產(chǎn)品名稱：牛支原體(mycoplasma)單重?zé)晒釶CR檢測試劑盒
產(chǎn)品貨號：SYA507
產(chǎn)品規(guī)格：48次/盒

一、簡介
本試劑盒用一對牛支原體特異性引物，結(jié)合一條特異性熒光探針，用熒光PCR技術(shù)對牛支原體的核酸進行體外擴增檢測，用于臨床上對可以感染者的病原學(xué)診斷。

二、用途
本試劑盒用于檢測氣管分泌物拭子、肺組織等樣本中的牛支原體(MB)，用于牛支原體(MB)感染的輔助診斷，其檢測結(jié)果僅供參考。

三、試劑盒組成(48T)
組份 數(shù)量 規(guī)格
MB反應(yīng)液(MB-qPCR MIX) 1管 672μL/管
核酸提取液(DNA Extraction ) 2管 1.5mL/管
酶混合物(Enzymes MIX) 1管 48μL/管
陰性對照(NTC) 1管 50μL/管
MB陽性對照(MB-PTC) 1管 50μL/管

四、儲存條件及有效期：
本試劑盒于-20℃以下保存，有效期為12個月。

五、熒光PCR儀器適用范圍：
ABI系列，Roche系列等熒光定量PCR檢測儀等。

六、樣品的采集與DNA提取
6.1 樣品的采集
病死或撲殺牛，無菌采集肺病變部位或病變/非病變部位交界處的樣品；病牛滅菌棉拭子沾取氣管分泌物，放入無菌試管中。
6.2 樣品前處理
組織樣品：每份組織分別從3個不同的位置稱取樣品約1g，手術(shù)剪剪碎混勻后取0.05g于研磨器中研磨，加入1.5mL生理鹽水后繼續(xù)研磨，待勻漿后轉(zhuǎn)至1.5mL滅菌離心管中，8000rpm離心2min，取上清液100μL于1.5mL滅菌離心管中。
6.3 DNA提取
可采用PCR試劑盒配備的DNA抽提液，按以下說明進行DNA核酸的粗提。也可采購北京百奧萊博科技有限公司生產(chǎn)的DNA提取試劑盒(過柱法-熒光配套)或其他合適的商業(yè)化產(chǎn)品，并按照相應(yīng)試劑盒說明進行操作。
對上述處理好的樣本加入等體積核酸提取液(固體標本加入50μL核酸提取液)，100℃恒溫處理10min，13000rpm離心5min，取上清液轉(zhuǎn)移至新的1.5mL EP管，-20℃保存；
 注：陽性對照和陰性對照為已經(jīng)抽提好的核酸(無需提取)，直接取5μL加入到反應(yīng)體系中即可。由于陽性對照濃度較高，建議zuì后在樣品制備區(qū)域加入陽性對照。

七、檢測步驟：
7.1 PCR擴增
從試劑盒中取出熒光PCR反應(yīng)液(MB-qPCR MIX)、酶混合物(DNA Polymerase MIX)，室溫融化并振蕩混勻后，10000rpm離心10s。
設(shè)所需要的PCR反應(yīng)管管數(shù)為N(N=樣本數(shù)+1管陰性對照+1管陽性對照)，每個測試反應(yīng)體系配制如下表：

試劑 每個反應(yīng)加入的量 N個反應(yīng)加入的量
熒光PCR反應(yīng)液 14μL N×14μL
酶混合物 1 μL N×1 μL
總量 15 μL N×15μL
計算好各試劑的使用量，加入一適當體積潔凈離心管中，充分混勻，10000rpm離心10s，向設(shè)定的N個PCR反應(yīng)管中分別加入15μL，向每管中加入處理后樣品或陰性對照(NTC)和陽性對照(MB-PTC)5μL，10000rpm瞬時離心10秒。
7.2 qPCR反應(yīng)條件
將各反應(yīng)管放入定量PCR儀器的反應(yīng)槽內(nèi)。
推薦循環(huán)條件:
1循環(huán) 50℃ for 2 min
預(yù)變性 1循環(huán) 95℃ for 10 min
PCR擴增 40循環(huán) 95℃ for 15 sec
60℃ for 60 sec
在60℃ 延伸時收集熒光信號。報告基團：設(shè)置為FAM。淬滅基團：NONE，請勿選擇ROX 參比熒光。

八、結(jié)果分析：
8.1 結(jié)果分析條件設(shè)定
直接讀取檢測結(jié)果?；€和閾值設(shè)定原則根據(jù)儀器噪聲情況進行調(diào)整，以閾值線剛好超過正常陰性樣品擴增曲線的zuì高點為準。
8.2 試驗成立判定
（1） 陰性對照(NTC)：不應(yīng)產(chǎn)生任何的擴增曲線。
（2） 陽性對照(MB-PTC)：均產(chǎn)生擴增曲線。
（3） 以上條件應(yīng)同時滿足，否則，此次試驗視為無效。
8.3 結(jié)果判定
（1） 在試驗成立的條件下，Ct值≤35，且曲線有明顯的指數(shù)增長曲線，表明MB核酸陽性。
（2） Ct值顯示為無的樣本為陰性樣本，表明MB核酸陰性。
（3） 如果Ct值>35，判為可疑樣品。對于可疑樣品，先看擴增曲線。如果擴增曲線為對數(shù)擴增曲線，則為可疑陽性，否則判為陰性。
（4） 對于可疑陽性樣品，重新抽提核酸，再次進行MB核酸檢測。如果重復(fù)擴增曲線為對數(shù)擴增曲線，判為樣本陽性，表明MB核酸陽性；否則判為樣本陰性。

九、注意事項：
（1） 初次使用前請仔細閱讀說明書。并嚴格按照說明書步驟操作。
（2） 所有使用的離心管zuì好高壓滅菌，而且必須不含DNA酶。
（3） PCR操作應(yīng)嚴格按照要求分區(qū)(試劑配制區(qū)、標本處理區(qū)、PCR擴增區(qū)等)，防止實驗室污染。
（4） 樣本提取、試劑配置、加樣需在不同區(qū)的超凈工作臺進行，以免污染。
（5） 試劑盒里所有物品應(yīng)視為污染物對待，并按照衛(wèi)生部《微生物生物醫(yī)學(xué)實驗室生物安全通則》進行處理。


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