真菌膜蛋白提取試劑盒（小型真菌）是一種快速高效的高產(chǎn)膜蛋白提取試劑盒。真菌膜蛋白提取試劑盒（小型真菌）可以從除了大型真菌（蕈菌）以外的各種小型真菌（絲狀真菌等）中提取膜蛋白。優(yōu)化的裂解液配方可以充分釋放各種有隔膜菌絲和無(wú)隔膜菌絲蛋白以及各種菌絲變態(tài)體蛋白中提取膜蛋白，可用于純化蛋白的粗品制備及膜蛋白...

真菌膜蛋白提取試劑盒(小型真菌)

 

產(chǎn)品編號(hào)：HR8092

產(chǎn)品組成：

保存條件：

蛋白酶抑制劑-20℃保存；蛋白提取液2-8℃保存。有效期1年。

【注】：

● 蛋白酶抑制劑未開蓋使用前也可以2-8℃儲(chǔ)存。開蓋使用后-20℃儲(chǔ)存。

● 蛋白酶抑制劑在2-8℃低溫時(shí)是固體狀態(tài)，從冰箱取出后恢復(fù)至室溫或37℃短時(shí)間水浴，變成液體狀態(tài)后離心至管底部再開蓋。

真菌膜蛋白提取試劑盒(小型真菌)產(chǎn)品簡(jiǎn)介：

跨膜蛋白承擔(dān)各種生物功能，在各種生命活動(dòng)如細(xì)胞的增殖和分化、能量轉(zhuǎn)換、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)及物質(zhì)運(yùn)輸?shù)鹊陌l(fā)生、發(fā)展過程中扮演重要角色。膜蛋白樣品的制備需要充分考慮到與下游的膠分析及質(zhì)譜分析等應(yīng)用配套，因此膜蛋白樣本制備成為一個(gè)難以逾越的挑戰(zhàn)。

真菌膜蛋白提取試劑盒（小型真菌）是一種快速高效的高產(chǎn)膜蛋白提取試劑盒。真菌膜蛋白提取試劑盒（小型真菌）可以從除了大型真菌（蕈菌）以外的各種小型真菌（絲狀真菌等）中提取膜蛋白。優(yōu)化的裂解液配方可以充分釋放各種有隔膜菌絲和無(wú)隔膜菌絲蛋白以及各種菌絲變態(tài)體蛋白中提取膜蛋白，可用于純化蛋白的粗品制備及膜蛋白制備。提取過程簡(jiǎn)單方便。

本試劑盒含有的獨(dú)特配方能夠有效溶解細(xì)胞膜組份，包括細(xì)胞質(zhì)膜、核膜和各種細(xì)胞器膜。本試劑盒含有的蛋白酶抑制劑混合物，阻止了蛋白酶對(duì)蛋白的降解，為提取高純度的蛋白提供了保證。

本試劑盒提取的蛋白可用于Western Blotting、蛋白質(zhì)電泳、免疫沉淀、ELISA、轉(zhuǎn)錄活性分析、

Gel shift凝膠阻滯實(shí)驗(yàn)、酶活性測(cè)定等下游蛋白研究實(shí)驗(yàn)。

本試劑盒提取的蛋白為具有天然蛋白構(gòu)象的活性蛋白。

本試劑盒中不含有EDTA，與金屬螯和層析等下游應(yīng)用兼容。

本試劑盒提取的蛋白樣本含有高濃度的鹽成分，不可直接用于2D電泳，如下游實(shí)驗(yàn)需要直接用于等電聚焦、雙向電泳，請(qǐng)使用其他貨號(hào)的試劑盒。也可以將最后樣品除鹽后再用于2D電泳，用脫鹽柱脫鹽處理（相關(guān)產(chǎn)品HR0389）。

產(chǎn)品特點(diǎn)：

● 使用方便。

● 含蛋白穩(wěn)定劑，提取的蛋白穩(wěn)定。

● 紫外檢測(cè)蛋白濃度時(shí)，背景干擾低。

● 蛋白酶抑制劑抑制了蛋白的降解，蛋白酶抑制劑配方優(yōu)化。蛋白酶抑制劑混合物包含6種獨(dú)立的蛋白酶抑制劑；每一種抑制劑可特異性抑制某一種或幾種蛋白酶活性。該混合物優(yōu)化的組成使其可以抑制幾乎所有重要的蛋白酶活性，包括絲氨酸蛋白酶、半胱氨酸酸蛋白酶、天冬氨酸蛋白酶、丙氨酰-氨基肽酶等。

試劑盒以外自備試劑和儀器：

● 離心機(jī) ● 渦旋混勻器 ● 振蕩器 ● 勻漿機(jī)/勻漿器 ● PBS ● 蛋白定量試劑盒

真菌膜蛋白提取試劑盒(小型真菌)使用注意事項(xiàng)：

● 旋帽離心管裝的試劑在開蓋前請(qǐng)短暫離心，將蓋內(nèi)壁上的液體甩至管底，避免開蓋時(shí)液體灑落。

● 實(shí)驗(yàn)過程中的所有試劑須預(yù)冷；所有器具須放-20℃冰箱預(yù)冷。整個(gè)過程須保持樣品處于低溫。

● 蛋白酶抑制劑儲(chǔ)存期間溶液如果出現(xiàn)沉淀，不影響使用，溶解后正常使用。

● 可以根據(jù)自己實(shí)驗(yàn)需要加入其它蛋白酶抑制劑單品。

● 提取液A在使用前須一直置于2-8℃條件，否則下游膜蛋白提取時(shí)會(huì)導(dǎo)致不容易分層。

● 膜蛋白電泳時(shí)loading buffer應(yīng)該避免煮沸。

● 膜蛋白電泳時(shí)可以提高loading buffer的SDS含量。

使用方法：

1、提取液準(zhǔn)備：

每500μL冷的提取液A和C中各加入1μL蛋白酶抑制劑混合物，充分混勻后置冰上備用。

【注】：

● 根據(jù)需要處理的樣品數(shù)量準(zhǔn)備蛋白提取液，蛋白酶抑制劑混合物不可以一次全部加入提取液。

● 加過蛋白酶抑制劑的提取液一周內(nèi)未使用完，再次使用前需要再次加入蛋白酶抑制劑。

● 以下步驟中使用的蛋白提取液為此步配制好的含蛋白酶抑制劑的提取液。

2、收集50-200mg真菌樣本，用PBS洗2次，在4℃，5000×g條件下離心5分鐘，小心吸取PBS，盡可能吸干，收集菌體。

【注】：

● 細(xì)胞數(shù)量根據(jù)實(shí)驗(yàn)情況調(diào)整，每次的裂解液用量并不是一定的，請(qǐng)根據(jù)實(shí)際情況調(diào)整。

● 由于膜蛋白含量較少，需要較多的細(xì)胞才能保證得率。在條件允許的情況下，盡可能加大細(xì)胞上樣量。

3、加入500μL冷的提取液A后用勻漿機(jī)/勻漿器充分勻漿。

【注】：

● 也可置于研缽中用液氮研磨，研磨后加入500μL冷的提取液A。

● 沒有液氮研磨條件，也可加入500μL 提取液A直接置冰上研磨。

● 提取液A在使用前須一直置于2-8℃條件，否則下游膜蛋白提取時(shí)會(huì)導(dǎo)致不容易分層。

4、在2-8℃低溫條件下持續(xù)振蕩1-2小時(shí)。

【注】：

● 此步驟必須在2-8℃條件振蕩。

● 使用振蕩器/搖床的較低轉(zhuǎn)速，提取液能輕微晃動(dòng)即可。

● 沒有2-8℃振蕩條件也可以不振蕩，置2-8℃靜置，稍微延長(zhǎng)提取液的處理時(shí)間，中間每隔幾分鐘用移液器吹打混勻即可。

5、將提取液在2-8℃下10000×g離心5分鐘，取上清。

6、在上清中加入5μL抽提液B，充分混勻。

7、在37℃水浴10分鐘。

8、在37℃條件下1000×g離心5分鐘。

【注】：

● 此步驟必須37℃條件下離心。

● 如果離心機(jī)不可控溫，可以不離心，延長(zhǎng)上一步驟水浴時(shí)間，至溶液逐漸澄清，分層清晰即可?；蛘咴谑覝貤l件下離心，縮短離心時(shí)間至1分鐘。

9、此時(shí)溶液分為2層，小心移除上層，留下下層管底部大約50μL液體。

【注】：

● 下層為粘稠狀液體。

● 有時(shí)還沒有分層完全時(shí)看上去可能像3層，保留中間的界面層即可。

10、用1-2倍體積冷的膜蛋白溶解液C溶解該溶液，即得膜蛋白樣品。

【注】：

● 膜蛋白比較難溶解，不能很快溶解混勻，可以在加入溶解液后稍微吹打混勻，然后置于4℃冰箱靜置至溶解。中途用移液器輕輕吹打混勻一次。靜置后取出再次用移液器稍微吹打混勻即可。

● 靜置直至管底透明膠狀物完全溶解。

11、將上述蛋白提取物定量后分裝于-80℃冰箱保存?zhèn)溆没蛑苯佑糜谙掠螌?shí)驗(yàn)。

【注】：

● 建議用BCA法進(jìn)行蛋白定量。相關(guān)產(chǎn)品：HR0329。

● 蛋白樣品-80℃存放一年沒有問題。注意不要被蛋白酶水解掉，不要被細(xì)菌污染。

常見問題分析：

● 蛋白濃度低？

膜蛋白豐度較低，需要盡可能真菌上樣量。處理部分組織樣本時(shí)可能沒有裂解完全，導(dǎo)致蛋白濃度低。只要適當(dāng)延長(zhǎng)試劑A的處理時(shí)間即可。最好在持續(xù)振蕩的條件下處理，沒有振蕩器也可間隔幾分鐘用吸頭吹打混勻。

● 用什么方法定量蛋白？

建議用BCA法。不適合用Bradford法，因?yàn)樵噭〢中含有干擾Bradford法的組份，導(dǎo)致定量不準(zhǔn)。如果已經(jīng)進(jìn)行過透析處理或者用脫鹽柱改換過緩沖體系，則可以用Bradford法定量。

● 提取的蛋白具有活性嗎？

本試劑盒不含有離子型去垢劑組份，不破壞蛋白的結(jié)構(gòu)，沒有對(duì)蛋白質(zhì)之間原有的相互作用的破壞，蛋白均保持其天然構(gòu)象和活性。

● 膜蛋白電泳沒有條帶？

膜蛋白樣品通常濃度較低，電泳前一定要進(jìn)行蛋白定量，以保證電泳是蛋白上樣量足夠。

膜蛋白提取好后，用溶解液充分溶解后，可以超聲處理一下，再進(jìn)行蛋白定量。

蛋白加Loading buffer后可以不用煮沸，采用50℃保溫30分鐘。

蛋白Loading buffer中SDS終濃度含量可以提高至3%-10%。

有些樣品的膜蛋白含量太低，可以使用丙酮沉淀膜蛋白，再使膜蛋白溶解于上樣緩沖液中，一般可以跑出清晰的蛋白條帶。

電泳時(shí)最后采用低電壓低電流電泳。

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