零背景通用型克隆試劑盒是高品質(zhì)的克隆與表達產(chǎn)品，由北京百奧萊博供應(yīng)，本產(chǎn)品僅用于生物化學研究方面，本產(chǎn)品質(zhì)量好，且具價格，深為用戶稱道，了解更多零背景通用型克隆試劑盒等克隆與表達產(chǎn)品請聯(lián)系我司咨詢訂購。...

特別提示：包括零背景通用型克隆試劑盒(Amp抗性)在內(nèi)，本公司的所有產(chǎn)品僅可用于科研實驗，嚴禁用于臨床醫(yī)療及其他非科研用途！

產(chǎn)品名稱：零背景通用型克隆試劑盒(Amp抗性)
英文名稱：Universal Cloning Kit(Resistance to Ampicillin)
產(chǎn)品貨號：BTN16068
產(chǎn)品規(guī)格：25次



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貨號	名稱	規(guī)格
BTN60106	pression/BTN60106.html" target="_blank">平末端DNA加T試劑盒	50次
BTN120696	pression/BTN120696.html" target="_blank">土霉素鹽酸鹽溶液	10mL
YT412	pression/YT412.html" target="_blank">EDTA溶液(0.5M)(pH8.0)	100ml
YT458	pression/YT458.html" target="_blank">TNF-α啟動子熒光素酶報告基因質(zhì)粒	1μg
YT480	pression/YT480.html" target="_blank">N端HA標簽融合蛋白質(zhì)粒	1μg
SY0281	pression/SY0281.html" target="_blank">零背景TOPO-TA克隆試劑盒	20T
MQ0005	pression/MQ0005.html" target="_blank">T1化學感受態(tài)細胞	20×100μl/100×100μl

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名稱：單細胞裂解液(DNA提取)
貨號：BTN130803
規(guī)格：1mL
本產(chǎn)品為單細胞DNA提取專用裂解液，本裂解液經(jīng)多次優(yōu)化，含有多種去污劑、變性劑和鹽，可有效抑制核酸酶在裂解過程中對核酸的破壞，維持核酸結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定。純化所得DNA可用于全基因組擴增(WGA)等實驗。本產(chǎn)品足夠使用200次以上。

儲存條件：低溫運輸，4℃保存，有效期兩年。

名稱：pUCm-T載體
貨號：BTN160101
規(guī)格：1μg
本產(chǎn)品是一種克隆PCR產(chǎn)物(TA Cloning)的專用載體。本載體由pUC系列載體改造而成，在pUC載體的多克隆位點處插入特殊的限制性內(nèi)切酶識別位點，酶切后能在載體的3′端形成懸掛的“T”末端。很多DNA聚合酶在進行PCR擴增時會在PCR產(chǎn)物雙鏈DNA 每條鏈的3′端加上一個突出的堿基A。這樣，pUCm-T載體的兩端就可以和PCR產(chǎn)物的兩端進行正確的AT 配對，在連接酶的催化下，就可以把PCR產(chǎn)物連接到，pUCm-T載體中，形成含有目的片斷的重組載體?？梢酝ㄟ^藍白斑篩選有插入片斷的重組克隆，大大提高了3′末端A 突出PCR產(chǎn)物的連接、克隆效率。本產(chǎn)品應(yīng)用于進行TA 克隆，克隆PCR產(chǎn)物。對克隆后的PCR產(chǎn)物可以用M13通用引物進行DNA 測序。

儲存條件：低溫運輸，-20℃保存，有效期一年。

使用方法：

一. 實驗準備
1. PCR產(chǎn)物3′末端帶有突出的A堿基：Taq、Tth、Ampli Taq、Klen Taq DNA聚合酶擴增的PCR產(chǎn)物3′末端均帶有突出的A堿基。建議擴增的PCR產(chǎn)物通過瓊脂糖凝膠電泳進行回收，再進行連接轉(zhuǎn)化實驗。
2. PCR產(chǎn)物3′末端沒有突出的A堿基：Pfu、Pwo、Tli或DeepVent等DNA聚合酶具有3′5′外切酶活性，其擴增的PCR產(chǎn)物末端可能不帶有3′A，要對這種平末端PCR產(chǎn)物進行克隆，應(yīng)先對其進行3′末端加A，再進行連接轉(zhuǎn)化實驗。

二.連接反應(yīng)
3.在一個標準的10mL連接反應(yīng)體系中，加入下列成分：

反應(yīng)組分	10μl反應(yīng)體系
插入的目的片段	xμL(0.2 pmol)
本產(chǎn)品	1μL(50 ng)
10×連接酶緩沖液	1μL
T4 DNA連接酶	3-5 U
補水到	10 L

 注意:一般zuì后加入T4 DNA連接酶。
4. 用移液器吹打反應(yīng)混合液使之混勻后，16-23℃連接1～12小時(或按T4 DNA連接酶供貨商提供的操作手冊進行連接)。

三．細菌轉(zhuǎn)化和鑒定
5. 將100μl感受態(tài)細胞置于冰上解凍后，完全解凍后輕輕將細胞均勻懸浮。
6. 加入上述5μl連接液，輕輕混勻，冰上放置30分鐘。
7. 42℃水浴熱激90秒，再冰上放置15～20分鐘。
8. 加入400μl自備的SOC培養(yǎng)基，37℃ 200～250rpm振蕩培養(yǎng)1小時。
9. 4000rpm離心5分鐘，用槍頭吸掉400μl上清液，用剩余的培養(yǎng)基將細胞懸浮。
10. 將細菌懸液均勻涂布在含20μl的IPTG(100mM)和100μl的X-gal(20mg/mL)的氨芐青霉素抗性的自備的LB平板上。(涂布菌液的用量可以根據(jù)連接的效率及感受態(tài)細胞的轉(zhuǎn)化效率而進行適當?shù)恼{(diào)整。)
11. 將平板于37℃培養(yǎng)1小時，然后倒置培養(yǎng)過夜。(先將平板正向放置1小時，以吸收過多的液體。)

四．篩選
12.轉(zhuǎn)化子的藍白篩選：
 當外源DNA片段插入到pUCm-T載體中后，由于外源DNA的核酸序列存在改變了LacZ基因的編碼，從而影響了其產(chǎn)物β-半乳糖苷酶α-片段的活性，因此重組克隆在-gal/IPTG 平板上呈現(xiàn)為白色，而非重組克隆呈藍色。選擇在IPTG/X-gal 平板上生長的白色菌落，用牙簽挑至含氨芐青霉素的液體培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)過夜。
13.轉(zhuǎn)化子的鑒定：
1)用上述培養(yǎng)的白色菌落的菌液抽提質(zhì)粒，用PstI單酶切或用其它合適的酶切,瓊脂糖凝膠電泳檢查片段大小，確定是否含有目的片段。
2)用M13通用引物或其它合適的引物直接進行測序來確定是否含有目的克隆。

操作提示：
1. PCR產(chǎn)物的純度：
 連接反應(yīng)前需用瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR反應(yīng)產(chǎn)物，如果電泳檢測PCR產(chǎn)物條帶彌散，或出現(xiàn)非特異條帶，則需要切下目的條帶，用膠回收試劑盒對目的片段進行回收。若PCR產(chǎn)物電泳檢測只有預(yù)期大小的明顯條帶，也應(yīng)使用PCR產(chǎn)物純化試劑盒直接純化PCR產(chǎn)物，以除去引物二聚體。不經(jīng)純化的PCR產(chǎn)物在某些條件下可直接用于連接，但由于引物二聚體和PCR產(chǎn)物中其它物質(zhì)的影響，造成含有插入片段的陽性克隆數(shù)減少，因而需要篩選很多克隆方可得到含有目的PCR產(chǎn)物的陽性克隆。
2. 平端PCR產(chǎn)物
 具有校正活性的熱穩(wěn)定性DNA聚合酶如Pfu、Pwo、Tli在進行PCR擴增時產(chǎn)生平端PCR產(chǎn)物。這種平端PCR產(chǎn)物可以進行3′末端加A 尾后連接到pUCm-T載體中，采用這種方法進行連接，可大大提高克隆的效率。
3.優(yōu)化插入片段和載體的摩爾比
1)pUCm-T載體優(yōu)化的插入DNA片段和載體的摩爾比為3:1，采用3-10:1的連接比例也可成功進行連接。如果你的PCR產(chǎn)物開始連接的不理想，則有必要優(yōu)化連接比例。
2)PCR產(chǎn)物的量可采用以下公式進行換算：
PCR片段的量(ng)= [加入載體的量(ng)×插入片段大小(kb)/載體大小(kb)]×插入片段和載體的摩爾比
4.篩選含插入片段的轉(zhuǎn)化子
插入片段成功克隆到pUCm-T載體中，可阻斷β-半乳糖苷酶的編碼序列，因而重組克隆可在指示培養(yǎng)基上通過顏色進行篩選。大多數(shù)情況下含有PCR產(chǎn)物的克隆菌為白色，如果PCR片段和LacZ基因在同一讀碼框內(nèi)，即PCR片段堿基數(shù)是3的整數(shù)倍(含3′-A)，并且讀碼框無終止密碼子，則重組克隆菌可能為藍色。

質(zhì)粒圖譜：


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