Western Blot操作步驟和產(chǎn)品選擇指南

一、 Western blot 實(shí)驗(yàn)步驟概述
1. 組織取材：組織塊稱重
2. 利用液氮、研缽粉碎組織塊 
3. 加入RIPA緩沖液(每克組織3 ml RIPA)，PMSF(每克組織30μl，10 mg/ml PMSF)，進(jìn)一步勻漿(15,000轉(zhuǎn)/分*1分鐘)維持4℃ 
4. 加入PMSF，冰上孵育30分鐘
5. 移入離心管4℃ 約20,000 g(約15,000轉(zhuǎn))15分鐘
6. 上清液為細(xì)胞裂解液可分裝-20℃保存
7. 進(jìn)行BCA 蛋白定量或者Bradford比色法測(cè)定蛋白質(zhì)濃度
8. 取相同質(zhì)量的細(xì)胞裂解液(體積*蛋白質(zhì)濃度)，并加等體積的2×電泳加樣緩沖液
9. 沸水浴中3分鐘 
10. 上樣 
11. 電泳(濃縮膠20mA，分離膠35mA)
12. 電轉(zhuǎn)膜儀轉(zhuǎn)膜(100mA 40分鐘)
13. 膜用超敏可逆蛋白膜染色，膠用考馬斯亮藍(lán)染色或者快速蛋白染色試劑盒
14. Westernblot 試劑盒顯色
15. 分析比較記錄
二、 Western具體實(shí)驗(yàn)步驟
    Western，也稱Western blot、Western blotting、Western印跡，是用抗體檢測(cè)蛋白的重要方法之一。Western可以參考如下步驟進(jìn)行操作。
1.收集蛋白樣品(Protein sample preparation)
  可以使用適當(dāng)?shù)牧呀庖毫呀赓N壁細(xì)胞、懸浮細(xì)胞或組織樣品。對(duì)于某些特定的亞細(xì)胞組份蛋白，例如細(xì)胞核蛋白、細(xì)胞漿蛋白、線粒體蛋白等，可以參考相關(guān)文獻(xiàn)提取這些亞細(xì)胞組份蛋白，也可以使用試劑盒進(jìn)行抽提。
收集完蛋白樣品后，為確保每個(gè)蛋白樣品的上樣量一致，需要測(cè)定每個(gè)蛋白樣品的蛋白濃度。根據(jù)所使用的裂解液的不同，需要采用適當(dāng)?shù)牡鞍诐舛葴y(cè)定方法。因?yàn)椴煌牡鞍诐舛葴y(cè)定方法對(duì)于一些去垢劑和還原劑等的兼容性差別很大。如果使用北京百奧萊博科技有限公司生產(chǎn)的RIPA細(xì)胞裂解液，配套PMSF(100mM)苯甲ji磺酰氟，定量可以使用BCA蛋白定量試劑盒。
2.電泳(Electrophoresis)
(1) SDS-PAGE凝膠配制
  SDS-PAGE凝膠可以參考一些文獻(xiàn)資料進(jìn)行配制，也可以使用北京百奧萊博生產(chǎn)的EasyPAGE 通用快速蛋白凝膠制備系統(tǒng)。該試劑盒提供了除水和配膠器具外的所有試劑以及配制各種濃度SDS-PAGE的配方。
(2) 樣品處理 
  在收集的蛋白樣品中加入適量濃縮的SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液。例如2X或5X的SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液。使用5X的SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液可以減小上樣體積，在相同體積的上樣孔內(nèi)可以上樣更多的蛋白樣品。2X或者5X的SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液可以參考相關(guān)文獻(xiàn)資料配制，也可以使用北京百奧萊博生產(chǎn)的SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液。100℃或沸水浴加熱3-5分鐘，以充分變性蛋白。
(3) 上樣與電泳 
  冷卻到室溫后，把蛋白樣品直接上樣到SDS-PAGE膠加樣孔內(nèi)即可。電泳緩沖液可采用10×蛋白電泳緩沖液
  為了便于觀察電泳效果和轉(zhuǎn)膜效果，以及判斷蛋白分子量大小，zui好使用預(yù)染蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)（另購(gòu)）。
電泳時(shí)通常推薦在上層膠時(shí)使用低電壓恒壓電泳，而在溴酚藍(lán)進(jìn)入下層膠時(shí)使用高電壓恒壓電泳。對(duì)于Bio-Rad的標(biāo)準(zhǔn)電泳裝置或類似電泳裝置，低電壓可以設(shè)置在80-100V，高電壓可以設(shè)置在120V左右。SDS-PAGE可以采用普通的電泳儀就可以滿足要求。為了電泳方便起見，也可以采用整個(gè)SDS-PAGE過程恒壓的方式，通常把電壓設(shè)置在100V，然后設(shè)定定時(shí)時(shí)間為90－120分鐘。設(shè)置定時(shí)可以避免經(jīng)常發(fā)生的電泳過頭。
  通常電泳時(shí)溴酚藍(lán)到達(dá)膠的底端處附近即可停止電泳，或者可以根據(jù)預(yù)染蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)的電泳情況，預(yù)計(jì)目的蛋白已經(jīng)被適當(dāng)分離后即可停止電泳。

3.轉(zhuǎn)膜(Transfer)
  我們推薦在Western實(shí)驗(yàn)中選用PVDF膜（另購(gòu)）。硝酸纖維素膜(NC膜)也可以使用（另購(gòu)），但硝酸纖維素膜比較脆，在操作過程中特別是用鑷子夾取等過程中容易裂開。膜的使用請(qǐng)參考生產(chǎn)商的推薦使用步驟。
   通常如果使用Bio-Rad的標(biāo)準(zhǔn)濕式轉(zhuǎn)膜裝置，可以設(shè)定轉(zhuǎn)膜電流為300-400mA，轉(zhuǎn)膜時(shí)間為30-60分鐘。也可以在15-20mA轉(zhuǎn)膜過夜。具體的轉(zhuǎn)膜時(shí)間要根據(jù)目的蛋白的大小而定，目的蛋白的分子量越大，需要的轉(zhuǎn)膜時(shí)間越長(zhǎng)，目的蛋白的分子量越小，需要的轉(zhuǎn)膜時(shí)間越短。
  在轉(zhuǎn)膜過程中，特別是高電流快速轉(zhuǎn)膜時(shí)，通常會(huì)有非常嚴(yán)重的發(fā)熱現(xiàn)象，zui好把轉(zhuǎn)膜槽放置在冰浴中進(jìn)行轉(zhuǎn)膜。 轉(zhuǎn)膜的效果可以觀察所使用的預(yù)染蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)，通常分子量zui大的1-2條帶較難全部轉(zhuǎn)到膜上。轉(zhuǎn)膜的效果也可以用超敏可逆蛋白染色試劑盒對(duì)膜進(jìn)行染色，以觀察實(shí)際的轉(zhuǎn)膜效果和了解是否蛋白上樣量一致。也可以用快速蛋白染色試劑盒對(duì)完成轉(zhuǎn)膜的SDS-PAGE膠進(jìn)行染色，以觀察蛋白的殘留情況。
4.封閉(Blocking)
  轉(zhuǎn)膜完畢后，立即把蛋白膜放置到預(yù)先準(zhǔn)備好的Western洗滌液10× 封閉/漂洗緩沖液中，漂洗1-2分鐘，以洗去膜上的轉(zhuǎn)膜液。從轉(zhuǎn)膜完畢后所有的步驟，一定要注意膜的保濕，避免膜的干燥，否則易產(chǎn)生較高的背景。
用微型臺(tái)式真空泵吸盡洗滌液，加入稀釋后10× 封閉/漂洗緩沖液，需要另外購(gòu)買脫脂奶粉。在搖床上緩慢搖動(dòng),室溫封閉60分鐘。對(duì)于一些背景較高的抗體，可以在4℃ 封閉過夜。
5.一抗孵育(Primary antibody incubation)
  參考一抗的說明書，按照適當(dāng)比例用Western一抗稀釋液稀釋一抗。
  用微型臺(tái)式真空泵吸盡封閉液，立即加入稀釋好的一抗，室溫或4℃在側(cè)擺搖床上緩慢搖動(dòng)孵育一小時(shí)。如果一抗孵育一小時(shí)效果不佳，可以在4℃緩慢搖動(dòng)孵育過夜。回收一抗。加入Western洗滌液，在側(cè)擺搖床上緩慢搖動(dòng)洗滌5-10分鐘。吸盡洗滌液后，再加入洗滌液，洗滌5-10分鐘。共洗滌3次。如果結(jié)果背景較高可以適當(dāng)延長(zhǎng)洗滌時(shí)間并增加洗滌次數(shù)。
6.二抗孵育(Secondary antibody inucubation)
  參考二抗的說明書，按照適當(dāng)比例用Western二抗稀釋液稀釋辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的二抗。
  用微型臺(tái)式真空泵吸盡洗滌液，立即加入稀釋好的二抗，室溫或4℃在側(cè)擺搖床上緩慢搖動(dòng)孵育一小時(shí)。
  回收二抗。加入Western洗滌液，在側(cè)擺搖床上緩慢搖動(dòng)洗滌5-10分鐘。吸盡洗滌液后，再加入洗滌液，洗滌5-10分鐘。共洗滌3次。如果結(jié)果背景較高可以適當(dāng)延長(zhǎng)洗滌時(shí)間并增加洗滌次數(shù)。
7.蛋白檢測(cè)(Detection of proteins)
  參考相關(guān)說明書，使用UltraECL, Western 熒光檢測(cè)試劑等ECL類試劑來檢測(cè)蛋白。 洗片時(shí)可以使用X光片自動(dòng)洗片機(jī)。如果沒有自動(dòng)洗片機(jī)，可以用顯影定影試劑盒自行配制顯影液和定影液進(jìn)行手工洗片。
8.膜的重復(fù)利用(Membrane recovery)
  如果蛋白樣品非常寶貴，可以使用蛋白印跡膜再生液Stripping Buffer處理蛋白膜，以重復(fù)利用蛋白膜
三、實(shí)驗(yàn)注意事項(xiàng)
1. 把聚丙烯酰胺凝膠中的蛋白質(zhì)電泳轉(zhuǎn)移到硝酸纖維膜上。
1)轉(zhuǎn)移緩沖液洗滌凝膠和硝酸纖維素膜，將硝酸纖維素膜鋪在凝膠上，用5ml移液管在凝膠上來回滾動(dòng)去除所有的氣泡。
2)在凝膠/濾膜外再包一張3mm濾紙(預(yù)先用轉(zhuǎn)移緩沖液浸濕)，將凝膠夾在中間，保持濕潤(rùn)和沒有氣泡。
3)將此濾紙/凝膠/薄膜濾紙按照廠家建議方法放入電泳裝置中，凝膠面向陰。
4)將上述裝置放入緩沖液槽中，并灌滿轉(zhuǎn)移緩沖液以淹沒凝膠。
5)按照廠家所示接通電源開始電泳轉(zhuǎn)移。
6)轉(zhuǎn)移結(jié)束后，取出薄膜和凝膠，棄去凝膠。 
2. 將薄膜漂在氨基黑中快速染色，直至分子量標(biāo)準(zhǔn)顯現(xiàn)時(shí)取出，記錄下標(biāo)準(zhǔn)位置。
3. 用100ml水洗滌纖維素膜，必要時(shí)可用脫色緩沖液。 
4. 膜置印跡緩沖液中于37℃保溫1小時(shí)。
5. 室溫下，用PBS-Tween緩沖液洗滌薄膜。
6. 用封口機(jī)將薄膜封入塑料袋中，盡可能不留空氣。
7．袋的一角剪一緩沖液的小口，用透析袋夾緊。
8．混合：NGS(100微升)，印跡緩沖液中的抗體(2.5-5毫升)，加在裝薄膜的袋中，于室溫下?lián)u動(dòng)2小時(shí)(或4℃過夜)
9．用總體積300ml PBS-Tween緩沖液，分4次在一淺盤中洗滌薄膜，每次75ml。
10．將連接生物素的羊抗兔IgG(40微升溶于10毫升印跡緩沖液/100微升 NGS)加在袋內(nèi)，于室溫下?lián)u動(dòng)1小時(shí)。 
11．按步驟9洗滌。
12．加入抗生素蛋白-HRP(40微升溶于10毫升印跡緩沖液/100微升 NGS)，于室溫下?lián)u動(dòng)。 
13. western blot中轉(zhuǎn)移在膜上的蛋白處于變性狀態(tài)，空間結(jié)構(gòu)改變，因此那些識(shí)別空間表位的抗體不能用于western blot檢測(cè)。這種情況可以將表達(dá)目的蛋白的細(xì)胞或細(xì)胞裂解液中的所有蛋白先生物素化，再用酶標(biāo)記親和素進(jìn)行western blot。實(shí)驗(yàn)中取膠和膜需帶手套。 
四、 關(guān)于內(nèi)參抗體
  眾所周知，要用Western Blot比較不同條件下或者不同組織中，目的蛋白表達(dá)量的相對(duì)多少，前提條件是等量的蛋白上樣，才有比較的基礎(chǔ)。特別是在表達(dá)量不高時(shí)，上樣量的差別就很可能影響結(jié)果的分析。所以需要內(nèi)參做對(duì)比。
  內(nèi)參即是內(nèi)部參照(Internal Control)，對(duì)于哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)來說一般是指由管家基因編碼表達(dá)的蛋白(Housekeeping Proteins)，它們?cè)诟鹘M織和細(xì)胞中的表達(dá)相對(duì)恒定，在檢測(cè)蛋白的表達(dá)水平變化時(shí)常用它來做參照物。在Western Blotting 實(shí)驗(yàn)中，除了需要進(jìn)行蛋白抽提、蛋白定量、等量蛋白上樣電泳、轉(zhuǎn)膜、靶蛋白抗體孵育、顯色等步驟以外，還需要進(jìn)行內(nèi)參的檢測(cè)，以校正蛋白質(zhì)定量、上樣過程中存在的實(shí)驗(yàn)誤差，以保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性。
  在國(guó)外發(fā)表的文章中，Western Blotting 實(shí)驗(yàn)結(jié)果須進(jìn)行內(nèi)參校正已成為一種慣例。但是，仍有不少科研人員在Western Blotting實(shí)驗(yàn)中忽略了內(nèi)參的使用，將蛋白濃度測(cè)定作為規(guī)范需相互比較的各種樣品間上樣量等同的唯yi方法。然而各種蛋白質(zhì)濃度定量方法，都存在局限性，不能完全準(zhǔn)確的確定各種樣品的準(zhǔn)確蛋白濃度。 蛋白質(zhì)定量以后進(jìn)行電泳時(shí)需要等量上樣，此步驟也存在操作誤差。在Western blotting實(shí)驗(yàn)時(shí)使用內(nèi)參，即可簡(jiǎn)便地對(duì)定量和上樣步驟產(chǎn)生的誤差進(jìn)行校正。此外使用內(nèi)參可以作為空白對(duì)照，檢測(cè)蛋白轉(zhuǎn)膜情況是否完全、整個(gè)Western Blot顯色或者發(fā)光體系是否正常。
  實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析其實(shí)很簡(jiǎn)單：如果樣品蛋白量有限，只夠進(jìn)行一次電泳轉(zhuǎn)膜實(shí)驗(yàn)時(shí)，分別檢測(cè)樣品的內(nèi)參量和目的蛋白量。將各樣品目的蛋白量分別除以其內(nèi)參含量，得到的數(shù)值即為內(nèi)參校正后的各樣品中目的蛋白相對(duì)含量，再用此數(shù)值進(jìn)行樣品間的比較和分析，得到目的蛋白含量在不同樣品間的實(shí)際變化結(jié)果。如果樣品量充分，可以先檢測(cè)內(nèi)參，觀測(cè)樣品間內(nèi)參顯色條帶是否一致，根據(jù)差異大小調(diào)整各樣品的上樣量重新進(jìn)行Western Blotting實(shí)驗(yàn)，至內(nèi)參量一致為止；若內(nèi)參一致，即可進(jìn)行不同樣品間目的蛋白表達(dá)變化分析。這樣雖然麻煩一點(diǎn)，但是可以保證結(jié)果更有說服力，更可信。畢竟我們的實(shí)驗(yàn)是一種嚴(yán)謹(jǐn)?shù)墓ぷ鳌?br />